植物在生存与发育的过程中，会不断的受到温度、盐、干旱以及病虫害等逆境因子的影响，植物的抗逆性是由一系列基因通过复杂的调控网络来控制的。杨树是重要的造林用材树种，同时也是林木中的模式生物，对其进行分子层面上的深入研究将有力的促进林木抗逆分子育种的进展。然而，由于林木自身局限性，对杨树的抗逆分子机制的认识还远远落后于拟南芥、水稻等草本植物。杨树几丁质酶作为一类重要的抗逆基因，对其进行的克隆、表达及功能分析有助于揭示其在杨树抵御生物胁迫及非生物胁迫的分子机制。

几丁质酶普遍存在于细菌、真菌以及动植物中，通过水解几丁质中的β-1,4-糖苷键将几丁质多聚体降解为N-乙酰氨基葡萄糖寡体或单体(Cohen-Kupiec and Chet, 1998)，是一种重要的糖苷酶。在不同的物种中，几丁质酶承担着不同的功能。在细菌中，它通过降解几丁质类物质而成为了细菌获取营养的一种手段(Ubhayasekera, 2011)；在真菌中，几丁质酶协助改变细胞壁结构，促进真菌细胞生长与分裂(Shimono et al., 2002)；在高等生物，如昆虫和甲壳动物中，几丁质酶可以帮助它们脱去旧的外骨骼以保证它们正常的生长发育(Zhang et al., 2011; 吴青君等, 2000)。植物本身并不含有几丁质，其几丁质酶的功能主要与针对真菌病害的防御机制有关，Mauc等研究表明植物的几丁质酶可以抑制真菌菌丝及孢子的生长，还可以促使真菌的芽管及附属胞解体(Mauch et al., 1988)。

植物中的几丁质酶可以分成5大类：即第Ⅰ类至第Ⅴ类(Neuhaus et al., 1996)。前四类几丁质酶发现较早，研究的比较成熟，关于它们的分类及起源相对有了定论，而虽然距离第一个第Ⅴ类几丁质酶的发现也已经有了相当长一段时间(Melchers et al., 2003)，但对此类几丁质酶，却一直缺乏深入研究。此后，有研究在对植物几丁质酶进行结构与进化的分析时 (Hamel et al., 1997)，也忽略了该类几丁质酶。近年来，越来越多的研究者倾向于将该类几丁质酶作为一个独立的分支来研究(Passarinho and de Vries, 2002)。植物第Ⅴ类几丁质酶与细菌几丁质酶在序列上有高度的相似性，而与其它几类植物几丁质酶序列上差异均较大，可能具有完全不同的起源及进化模式。而作为相对古老的一类几丁质酶，目前对其进行的研究仍多局限在结构上，对其功能的分析相对较少。

Melchers等(2003)首先在烟草(Nicotiana tabacum)叶片中克隆了第Ⅴ类几丁质酶基因NtChiV，并对其进行了功能分析，发现NtChiV具有抗真菌功能，可以被烟草花叶病毒以及非生物胁迫所诱导。随后在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)等物种中也陆续发现了第Ⅴ类几丁质酶的存在(Ohnuma et al., 2011a; Salzer et al., 2004)，拟南芥的第Ⅴ类几丁质酶除了可以为一些非生物胁迫诱导以外，植物激素的处理同样可以使其表达量上调。而蒺藜苜蓿的第Ⅴ类几丁质酶则在根瘤菌存在时大量表达。对拟南芥以及烟草第Ⅴ类几丁质酶体外重组蛋白的抗真菌活性进行比较后发现，前者对真菌生长的抑制作用要远低于后者(Ohnuma et al., 2012)。可见，不同物种中的第Ⅴ类几丁质酶在功能上已经出现了比较大的分化。

本研究以毛果杨(Populus trichocarpa)基因组数据为基础，从加拿大杨(P. canadensis)中克隆到了一个编码第Ⅴ类几丁质酶的基因PcCHI3，在此基础上进行了氨基酸序列、蛋白结构以及系统进化的相关分析，并通过realtime PCR技术检测了该基因在触发子诱导、伤口处理、非生物胁迫及真菌侵染等条件下的表达模式。为更深入了解该基因在抗真菌病害及抗非生物胁迫过程中的作用机理提供参考。

1结果与分析
1.1基因全长cDNA的克隆及氨基酸序列分析
根据烟草第Ⅴ类几丁质酶CAA54374.1基因序列，在杨树基因组数据库中搜索比对，发现毛果杨中的POPTR_0006s20270.1与其具有高度同源性。根据POPTR_0006s20270.1序列设计引物进行3’RACE以及5’RACE的扩增，最终通过序列的拼接获得的cDNA全长为1 303 bp，包含了一个48 bp的5’UTR、一个157 bp的3’UTR以及一个编码了366个氨基酸的阅读框，该基因命名为PcCHI3，Genbank登录号为JQ291357.1。预测蛋白质分子量为39.53 kD，理论等电点(pI) 5.49。蛋白质的氨基酸组成分析显示：Ala (A)、Ser (S)、Gly (G)、Thr (T)、Leu (L)和Asn (N)含量较高，含量分别占总氨基酸的比例为12.0%、10.1%、8.7%、8.2%、7.9%和7.4%；酸性氨基酸(Asp+Glu)总数为22个，碱性氨基酸(Arg+Lys)总数为18个；平均亲水性(GRAVY)值为-0.027。跨膜区及信号肽的预测显示，该基因编码一个N端含23个氨基酸的信号肽且不含跨膜区的蛋白，说明该蛋白是分泌蛋白。亚细胞定位的预测同样支持了这一结论。

1.2蛋白质结构分析，同源性比对及系统进化树构建
PcCHI3编码的蛋白质的二级结构中含有35.25%的α螺旋(Alpha helix)、19.14%的延伸链(extended strand)、5.74%的β转角(beta turn)和39.89%无规则卷曲( random coil)，可见α螺旋和无规则卷曲是该蛋白二级结构的主要组成成分。

我们利用TASSER进行了蛋白质三级结构预测(图1A)，在三级结构数据库可以比对到一些结构相似的蛋白质，其中就包括烟草的第Ⅴ类几丁质酶NtChiV。将这两个蛋白质的三维结构在DaliLite服务器上进行比较后，发现两者有56%的相似度(图1B)。

图1 PcCHI3三维结构及其与烟草第Ⅴ类几丁质酶NtChiV的比较 Figure 1 Predicted 3D structures of PcCHI3 and comparative structure between PcCHI3 and NtCHIV in the Ⅴ class of Chitinase

将PcCHI3与来自拟南芥、葡萄(vitis vinifera)、玉米(Zea mays)、山药(Dioscorea japonica)、马铃薯(Solanum tuberosum)、大麦(Hordeum vulgare)、辣椒(Capsicum annuum)、烟草、地黄(Rehmannia glutinosa)、白羽扇豆(Lupinus albus)、苦瓜(Momordica charantia)、梨(pyrus pyrifolia)的几丁质酶序列进行系统进化关系分析，并构建几丁质酶的系统进化树(图2)。系统进化树显示，所有这些几丁质酶基因分成了两大分支，其中第1个分支又可以分成3个亚组，包括第Ⅰ、第Ⅱ和第Ⅳ类几丁质酶基因。第2个分支由第Ⅲ和第Ⅴ类几丁质酶基因组成。对这些基因编码的蛋白进行结构域的分析发现，第1个分支所有成员均含有Glyco_hydro_19 结构域而第2个分支则普遍含有Glyco_hydro_18结构域。杨树第Ⅴ类几丁质酶PcCHI3与苦瓜、烟草、梨的第Ⅴ类几丁质酶同属第2个分支的Ⅴ类几丁质酶亚组(图2)。同源比对的结果显示这几个几丁质酶的蛋白质序列相似性很大：N端的序列较特异，中间区域及C端的序列则比较保守，Glyco_hydro_18结构域就位于该保守的区段中。此外，在PcCHI3以及烟草和梨的第Ⅴ类几丁质酶中还发现了一类DxDxE基序，这类基序由两个天冬氨酸(Asp)，一个谷氨酸(Glu)以及两个其他氨基酸组成，普遍存在于糖苷水解酶18家族成员中(Synstad et al., 2003)。在不同物种比较中，杨树与梨的第Ⅴ类几丁质酶亲缘关系最近，氨基酸序列相似度达到了69% (图3)。

图2 PcCHI3的系统进化分析 Figure 2 Phylogenetic analysis of PcCHI3

图3 PcCHI3与梨、烟草、苦瓜的第V类几丁质酶氨基酸序列同源性比较 Figure 3 CLUSTAL multiple alignments of amino acid sequences among PcCHI3 and other chitinases in class V chitinase

1.3 PcCHI3的表达模式分析
以EF1α为内参基因，我们利用实时定量PCR来分析杨树几丁质酶在生物和非生物胁迫下的表达情况(图4)。几丁寡糖的诱导使得PcCHI3的表达出现了上调，但上调的幅度不大，其表达量仅仅是对照的1.98倍。而伤口的产生同样可诱导PcCHI3的表达出现轻微上调，在受伤2 h后该基因表达上调了1.84倍。

图4 PcCHI3在不同诱导条件的表达模式 Figure 4 Quantitative RT-PCR analysis of relative expression levels of PcCHI3 under various treatments

在盐胁迫以及干旱胁迫的诱导下，PcCHI3的表达分别上调了5.13以及4.05倍。而低温胁迫则对PcCHI3几乎没有诱导作用。

真菌的诱导导致了PcCHI3的表达量出现了剧烈的上调，且上调幅度随着侵染时间的延长逐渐提高。在侵染后12 h，孢子附着在叶片表面，此时处于侵染的初期，PcCHI3的表达量出现了轻微上调，为对照的1.82倍，随着侵染时间的延长，真菌的菌丝侵入叶片内部，到48 h左右进入侵染的中期。此时PcCHI3的表达量相比未侵染叶片上调了14.22倍，而在侵染后期，也就是在侵染开始后大约96 h，PcCHI3的表达量大幅上调，达到了未侵染叶片的83.07倍。

2讨论
植物中的几丁质酶基因以基因家族的形式存在，根据序列的不同可以分成5类。其中Ⅰ类，Ⅱ类以及Ⅳ类几丁质酶属于糖苷水解酶19家族，Ⅲ类和Ⅴ类则属于糖苷水解酶18家族。糖苷水解酶19家族的几丁质酶基因结构较复杂，一般都含有几丁质结合区、催化区和可变铰链区；而糖苷水解酶18家族仅含有催化区结构。糖苷水解酶19家族几丁质酶仅存在于植物中，而18家族几丁质酶普遍存在于各种生物中(刘栋峰等, 2009)，且18家族的两类成员在结构与序列上的分化要明显大于糖苷水解酶19家族的几类成员。这与它们不同的起源及进化方式相关，反应了它们不同的进化地位。

植物中的几丁质酶基因主要的功能是抵御真菌病原菌对植物的攻击。近年来，关于植物几丁质酶在逆境诱导、生长发育等生命活动过程中的作用也逐渐被发现。但是并非所有的几丁质酶基因的功能都是相同的。在不同的几丁质酶基因之间存在着显著的功能分化。这种功能上的差异不仅反映在5大类基因之间，在同类不同成员间也有所体现。

本研究从加拿大杨中克隆到一个第Ⅴ类几丁质酶基因PcCHI3，该基因与烟草、苦瓜、梨等的第V类几丁质酶同属一个进化分支，与梨的第Ⅴ类几丁质酶亲缘关系最近，这可能与它们同属木本植物有关。序列及结构分析发现，除了苦瓜，在其它几个物种的第Ⅴ类几丁质酶蛋白质序列中均发现了DxDxE基序。有研究认为，这类基序与几丁质酶的催化活性密切相关(Synstad et al., 2003)。由此推测，杨树、烟草以及梨中的第Ⅴ类几丁质酶可能比苦瓜第Ⅴ类几丁质酶活性更高。烟草NtChiV是第一个发现，也是研究的最为深入的植物第Ⅴ类几丁质酶(Ohnuma et al., 2011b)。PcCHI3与NtChiV具有相似的氨基酸组成及蛋白质结构，说明他们可能来源于同一祖先，且该基因在进化过程中是保守的。这种较高的相似性同样反应在功能上。两者的表达均受到了各种非生物胁迫及生物胁迫的诱导。在非生物胁迫方面，与NtChiV一样，伤口的产生可以轻微诱导PcCHI3的表达。此外，PcCHI3可能还具有一些NtChiV不具有的功能，在盐胁迫以及干旱胁迫时的高表达就表明了PcCHI3可能参与了杨树对这两种逆境的抗性机制；在生物胁迫方面，NtChiV已经证明具有抗木霉(Trichoderma viride)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)等真菌病害的能力。而本研究的结果显示，当杨树叶片受到真菌病原菌杨生褐盘二孢菌的侵染时，PcCHI3出现大量的表达。这也反映了其在抵御真菌攻击的过程中可能发挥了重要的作用。PcCHI3也被几丁寡糖轻微诱导，而几丁质被认为是触发植物防御反应的重要触发子，这进一步证实了PcCHI3是杨树免疫系统中的重要基因。植物几丁质酶的抗真菌病害的机理，目前有两种观点(Roldán Serrano et al., 2007)：一种是几丁质酶可以破坏真菌细胞壁，从而抑制真菌生长。而另一种则认为，几丁质酶降解真菌细胞壁将释放出几丁质等病原相关分子模式(PAMPs)，从而诱导植物防御反应的发生。PcCHI3既在几丁寡糖处理后出现表达量的迅速上调，在病原真菌侵染的后期同样存在高表达，这表明这两种假设在PcCHI3上均有所体现。PcCHI3在受盐以及干旱胁迫时的表达模式几乎是一致的，这反映了植物对这两种胁迫的应答可能共有一条通路，或者这两种胁迫的应答通路有着部分的重合，而PcCHI3则恰好位于其重合部分。而从PcCHI3在干旱、高盐条件下以及受病原菌诱导时的表达均有所上调，可以推测该基因同时参与了杨树对生物以及非生物胁迫的应答。目前普遍认为植物的生物与非生物胁迫之间是存在着联系的，且这种联系是由激素和活性氧信号途径介导的。我们的结果表明了作为杨树第Ⅴ类几丁质酶，PcCHI3极有可能是这两条信号通路的下游基因。对它们之间的关系进行深入的研究有助于揭示植物的抗逆机制，并为今后的杨树抗逆育种建立基础。

3材料与方法
3.1材料
加拿大杨(Populus canadensis Moench)为二年生扦插苗，在温室培养，生长条件为温度25℃，相对湿度70%，16 h光照，8 h黑暗环境。其中盐胁迫及干旱胁迫采用的为水培植株。

3.2不同诱导处理
不同诱导处理均设置普通对照，不同诱导处理分别是：(1)几丁寡糖诱导，六聚几丁寡糖用无菌水配制成5 μmol/L的溶液均匀喷洒在杨树叶片上，1 h后收集叶片；(2)伤口诱导，用镊子在杨树叶片上沿中脉来回划3次，2 h后收集受伤的叶片；(3)低温胁迫，将植株转移到4℃环境中放置约12 h后，收集叶片；(4)盐胁迫，用300 mmol/L的氯化钠溶液替换水培苗中的水，并在12 h后收集植株的根；(5)干旱胁迫，用20% PEG溶液替换水培苗中的水，并在12 h后收集植株的根；(6)病原真菌侵染，选取杨树褐斑病的病原真菌杨生褐盘二孢菌(M. brunnea f. sp. multigermtubi)用于离体接种。采集在PDA培养基上培养十天的杨生褐盘二孢菌孢子，用无菌水清洗两到三遍，重悬至浓度为106孢子/毫升，将其均匀的喷洒到杨树叶片上。分别于接种后12 h、48 h和96 h后收集叶片材料。

3.3总RNA提取及反转录
采用Xu等(2009)改良后的CTAB法提取杨树组织总RNA。用DNaseⅠ (Takara, Japan)去除RNA中的基因组DNA污染后用PrimeScript™ RT-PCR Kit (Takara, Japan)试剂盒将RNA反转录成cDNA。程序为37℃15 min，85℃ 5s。反应产物用无菌水稀释3倍用作实时定量模板。 利用3’-Full RACE Core Set Ver. 2.0 (Takara, Japan) 以及5’-Full RACE Kit (Takara, Japan)合成cDNA第一链。产物分别用作3’RACE以及5’RACE的模板。

3.4目的基因全长cDNA序列的克隆
根据杨树数据库所提供的毛果杨序列，设计3’RACE，5’RACE的特异性引物进行巢式PCR，最终的反应产物切胶回收后连入pMD19-T simple Vetor (Takara, Japan)并转化大肠杆菌Top10，将PCR鉴定的阳性克隆测序。将得到的序列利用Bioedit软件拼接成完整的cDNA全长。

3.5序列分析
利用BioXM软件对获得的cDNA全长序列进行开放阅读框预测。蛋白质的分子量、等电点以及氨基酸组成均为ProtParam在线分析。SOPMA工具可对蛋白质二级结构进行分析。三级结构预测及不同蛋白结构的比较分别在TASSER (Roy et al., 2010)及DaliLite服务器上进行(Holm and Park, 2000)。Pfam 数据库预测蛋白质结构域。蛋白质信号肽、跨膜区以及亚细胞定位预测分别利用了SignalP、 TMHMM以及TargetP软件。系统进化树是由MEGA5.0软件的邻接法构建。

3.6实时定量PCR进行表达分析
采用oligo6.0进行qRT-PCR引物的设计，PcCHI-f：5'-TATCCATCCACCACTACTCAG-3'，PcCHI-r：5'-CAGGACCGTAGAAGTCATAG-3'。杨树延伸因子EF1α基因作为实时定量的内参基因。反应总体积为20 μL，由以下组分组成：2×SYBR Premix Ex Taq^TM (Takara, Japan) 10 μL，10 μmol/L PcCHI-f引物以及10 μmol/L PcCHI-r各0.4 μL，ROX reference dyeⅡ 0.4 μL，cDNA模板2 μL，6.8 μL Milli-Q water反应在Applied Biosystems 7500 Real-time PCR System上进行，程序为95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40个循环。在反应结束后对溶解曲线进行分析以排除非特异扩增的发生。每个反应设置3个重复。

作者贡献
江聪、宋佳亮和黄瑞芳是本研究的实验设计和实验研究的执行人；江聪、黄瑞芳完成数据分析，论文初稿写作；江聪、宋佳亮参与实验设计，试验结果分析；徐立安和黄敏仁是项目的构思者和负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家重点基础研究发展计划(2009CB119100)、国家林业局林业公益性行业科研专项(200904048)以及国家自然科学基金(31170620)共同资助。

参考文献
Cohen-Kupiec R., and Chet I., 1998, The molecular biology of chitin digestion, Curr. Opin. Biotechnol., 9(3): 270-277
http://dx.doi.org/10.1016/S0958-1669(98)80058-X
 
Hamel F., Boivin R., Tremblay C., and Bellemare G., 1997, Structural and evolutionary relationships among chitinases of flowering plants, J. Mol. Evol., 44(6): 614-624
http://dx.doi.org/10.1007/PL00006184
PMid:9169553 
 
Holm L., and Park J., 2000, DaliLite workbench for protein structure comparison, Bioinformatics, 16(6): 566-567
http://dx.doi.org/10.1093/bioinformatics/16.6.566
PMid:10980157 
 
Mauch F., Mauch-Mani B., and Boller T., 1988, Antifungal hydrolases in pea tissue II. Inhibition of fungal growth by combinations of chitinase and β-1, 3-glucanase, Plant Physiol., 88(3): 936-942
http://dx.doi.org/10.1104/pp.88.3.936
PMid:16666407 PMCid:1055685
 
Melchers L.S., Apotheker-de Groot M., van der Knaap J.A., Ponstein A.S., Sela-Buurlage M.B., Bol J.F., Cornelissen B.J., van den Elzen P.J., and Linthorst H.J., 2003, A new class of tobacco chitinases homologous to bacterial exo-chitinases displays antifungal activity, Plant J., 5(4): 469-480
http://dx.doi.org/10.1046/j.1365-313X.1994.5040469.x
 
Neuhaus J.M., Fritig B., Linthorst H.J.M., Meins F., Mikkelsen J.D., and Ryals J., 1996, A revised nomenclature for chitinase genes, Plant Mol. Biol. Rep., 14(2): 102-104
http://dx.doi.org/10.1007/BF02684897
 
Ohnuma T., Numata T., Osawa T., Mizuhara M., Lampela O., Juffer A.H., Skriver K., and Fukamizo T., 2011a, A class V chitinase from Arabidopsis thaliana: gene responses, enzymatic properties, and crystallographic analysis, Planta, 234(1): 123-137
http://dx.doi.org/10.1007/s00425-011-1390-3
PMid:21390509 
 
Ohnuma T., Numata T., Osawa T., Mizuhara M., Vårum K.M., and Fukamizo T., 2011b, Crystal structure and mode of action of a class V chitinase from Nicotiana tabacum, Plant Mol. Biol., 75(3): 291-304
http://dx.doi.org/10.1007/s11103-010-9727-z
PMid:21240541  
 
Ohnuma T., Taira T., and Fukamizo T., 2012, Antifungal activity of recombinant class V chitinases from Nicotiana tabacum and Arabidopsis thaliana, J. Appl. Glycosci., 59(1): 47-50
http://dx.doi.org/10.5458/jag.jag.JAG-2011_019
 
Passarinho P.A., and de Vries S.C., 2002, Arabidopsis chitinases: a genomic survey, Arabidopsis Book, 1: e0023
PMid:22303199 PMCid:3243303
 
Roldán Serrano A., Luna del Castillo J., Jorrín Novo J., Fernández Oca-a A., and Gómez Rodríguez M.V., 2007, Chitinase and peroxidase activities in sunflower hypocotyls: effects of BTH and inoculation with Plasmopara halstedii, Biologia Plantarum, 51(1):149-152
http://dx.doi.org/10.1007/s10535-007-0028-6
 
Roy A., Kucukural A., and Zhang Y., 2010, I-TASSER: a unified platform for automated protein structure and function prediction, Nat. Protoc., 5(4): 725-738
http://dx.doi.org/10.1038/nprot.2010.5
PMid:20360767 PMCid:2849174
 
Salzer P., Feddermann N., Wiemken A., Boller T., and Staehelin C., 2004, Sinorhizobium meliloti-induced chitinase gene expression in Medicago truncatula ecotype R108-1: a comparison between symbiosis-specific class V and defence-related class IV chitinases, Planta, 219(4): 626-638
http://dx.doi.org/10.1007/s00425-004-1268-8
PMid:15107993 
 
Shimono K., Matsuda H., and Kawamukai M., 2002, Functional expression of chitinase and chitosanase, and their effects on morphologies in the yeast Schizosaccharomyces pombe, Biosci. Biotechnol. Biochem., 66(5): 1143-1147
http://dx.doi.org/10.1271/bbb.66.1143
PMid:12092833 
 
Synstad B., Gåseidnes S., van Aalten D.M.F., Vriend G., Nielsen J.E., and Eijsink V.G.H., 2003, Mutational and computational analysis of the role of conserved residues in the active site of a family 18 chitinase, (European Journal of Biochemistry), 271(2): 253-262
http://dx.doi.org/10.1046/j.1432-1033.2003.03923.x
 
Ubhayasekera W., 2011, Structure and function of chitinases from glycoside hydrolase family 19, Polymer International, 60(6): 890-896
http://dx.doi.org/10.1002/pi.3028
 
Xu M., Zang B., Yao H.S., and Huang M.R., 2009, Isolation of high quality RNA and molecular manipulations with various tissues of Populus, Russian Journal of Plant Physiology, 56(5): 716-719
http://dx.doi.org/10.1134/S1021443709050197
 
Zhang J.Z., Zhang X., Arakane Y., Muthukrishnan S., Kramer K.J., Ma E., and Zhu K.Y., 2011, Comparative genomic analysis of chitinase and chitinase-like genes in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae), PloS one, 6(5): e19899
http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0019899
PMid:21611131 PMCid:3097210
 
Liu D.F., Zhang C.H., and Wang Y.J., 2009, Full-length cDNA clone and sequence analysis of the chitinase family gene from pear, Nongye Shengwu Jishu XueBao (Journal of Agricultural Biotechnology), 17(6): 1042-1049 (刘栋峰, 张朝红, 王跃进, 2009, 黄冠梨几丁质酶基因家族 cDNA 全长序列克隆与分析, 农业生物技术学报, 17(6): 1042-1049) 
 
Wu Q.J., Zhang W.J., and Zhang Y.J., 2000, Insect chitinase and its potential use in plant protection, Kunchong Zhishi (Entomological Knowledge), 37(5): 314-317 (吴青君, 张文吉, 张友军, 2000, 昆虫几丁质酶及其在植物保护中的应用, 昆虫知识, 37(5): 314-317)